آیا واقعا فیبروئین ابریشم برای بافت پوست مفید است ؟

فیبروئین ابریشم ، پروتئینی فیبری با خواص مکانیکی بسیار مطلوب است که توسط دسته بزرگی از جانوران از جمله کرم بومبیکس موری به شکل رشته ای ساخته می شود.

این مقاله کاملا علمی بوده و از دانشگاه صنعتی امیر کبیر منتشر شده است.
در این مقاله مفید بودن فیبروئین ابریشم در صنعت پزشکی به اثبات رسیده است.

چکیده

ساختار منحصر به فرد ابریشم، تنوع فرآوری، زیست سازگاری، در دسترس بودن آن به شکل های گوناگون، امکان اعمال مهندسی ژنتیک بر روی گونه های مختلف، قابلیت استریل شدن، شیمی سطح مناسب و تخریب پذیری کنترل شده، ابریشم را در کاربردهای بالینی، پزشکی، آرایشی بهداشتی و غذایی به ماده ای بی نظیر بدل کرده است.

در پژوهش حاضر استحصال و بررسی پروتئین فیبروئین از تار ابریشم بومبیکس موری با هدف کاربردهای پزشکی و بهداشتی انجام شد. خواص فیزیکی، شیمیایی و ساختاری ابریشم توسط XRD FTIR و SEM مورد بررسی قرار گرفت.

سلول های استئوبلاستی G292 به منظور بررسی خواص زیستی این بیومتریال بر روی آن کشت داده شد.

نمودار طیف FTIR فیبروئین ابریشم استخراج شده است که پیک هایی را در   ۱۵۳۰ –  ۱۹۵۰ – ۶۹۹ و cm 1239 نشان می دهد.

فیبروئین ابریشم همچنین پس از استخراج و پس از بازیابی با متانول از نظر میزان بلورینگی با دستگاه XRD مورد بررسی قرار گرفت که ظهور پیک در نمونه بازیابی شده نشان از تشکیل مجدد صفحات بتا داشت.

از الیاف ابریشم نیز قبل و بعد از صمغ زدایی با SEM تصویربرداری شد و قطر نسبی الیاف ابریشم بین ۱۶ تا ۲۶ میکرومتر تعیین شد. آزمون های زیست سازگاری بيرون تنی MTT برای بررسی قابلیت کاربرد آن در بدن انجام شد و سازگاری سلولها در مجاورت فیبروئین به اثبات رسید. استئوبلاست های چسبیده بر روی داربست ها توسط SEM مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی های فیزیکی و زیستی اولیه بر روی پروتئین فیبروئین ابریشم سازگار بودن آن با سیستم های زیستی را تایید کرد.

به نظر می رسد پروتیئن حاضر می تواند پیش ماده مناسبی برای تولید مواد مرتبط با سیستم های زیستی باشد.

مقدمه

ابریشم پروتئینی است که توسط برخی از بند پایان از جمله عنکبوت ها (بیش از ۳۰۰۰۰ نوع عنکبوت که از جمله معروف ترین آنها می توان به نقیلا کلاویپس اشاره کرد.) عقرب ها، کک ها و برخی از کرم های رسته پشپزبالان از جمله کرم پنیر، پروانه ها و بیدها، به صورت تار تنیده می شود.

این جانوران از تارهای ابریشم برای اهداف گوناگونی از جمله پناه گاه، لاته، محافظ تخم، وسیله حمل و نقل و ابزار شکار استفاده می کنند، ابریشمها بتایر منشاء تولید و کاربردشان ساختارهای گوناگون و خواص متفاوتی دارند.

عنکبوت ها و حشرات، ابریشمی غنی از گلايين ترشح می کنند که بر حسب نوع کاربردشان اختصاصی میشوند.

این ابریشم ها با ابریشم تولید شده توسط کرم های بومیکس موری، از جهات بسیاری متفاوت است.

ابریشم عنکبوت به دلیل سبکی، استحکام فوق العاده بالا، انعطاف و مقاومت در برابر ضربه، گزینه بسیار قابل توجهی به عنوان بیومتریال است.

خلاصه ای از مهم ترین خواص و تفاوت های ابریشم عنکبوت۔ ها و ابریشم کرم ابریشم در جدول ۱ آمده است

به رغم اینکه ثار ابریشم عنکبوت در مقایسه با ابریشم کرم ابریشم خواص مکانیکی برتری دارد، هنوز برای کاربردهای مهندسی پزشکی تجاری تشده است.

مهمترین دلایل این امر، وحشی بودن طبیعت عنکبوت ها و اندک بودن میزان تولید تار ابریشم توسط این جانوران است.

به منظور فائق آمدن بر این مانع قنی تحقیقات در این زمینه به سمت تولید پروتئین تار عنکبوت با استفاده روش های زیست فناوری سوق پیدا کرده است  از میان تمام جانورانی که ابریشم تولید می کنند، کرم ابریشم بومبیکس موزی از نظر اقتصادی بسیار به صرفه تر است.

زیرا اهلی کردن آن امکان پذیر بوده و دسترسی مناسبی به منابع تامین کننده این ابریشم وجود دارد از این رو تحقیقات زیادی برای درک ساختار، فرآوری و خواص آن به عنوان بیومتریال انجام شده است.

نگاهی به چرخه زندگی کرم ابریشم بومبیک موری نشان میدهد . این کرم در طی مدت دگردیسی پیله ای محافظ از جنس ابریشم به دور خود میتند.

مایع ویسکوزی که از غدد واقع در سر کرم ابریشم برای تنیدن پیله ترشح می شود، فیبروتین نام دارد.

فیبروئین ابریشم با ترشح دیگری که سریين نام دارد و از دو غده منقارن دیگر تراوش می کنند، پوشیده می شود.

این دو ماده در کنار هم در معرض هوا سخت می شوند و در مجموع این فرآیند تارهایی حاوی فیبروئین و سریسین را به وجود می آورد .

سریسین که صمغ ابریشم نیز نامیده می شود، پروتئینی زرد رنگ، توده و غير الاستیک است که ۲۰ تا ۳۰ درصد از تار ابریشم را تشکیل می دهد.

این پروتئین به دور فیبروتین پیچیده و لایه چسبنده ای را ایجاد می کند که در نهایت به شکل گیری پیله کمک می کند.

سریسین آنتی اکسیدان، آنتی باکتریال و مقاوم در پراپر پرتو فرا بنفش است اما معمولا حاوی ناخالصی هایی چون موم، چربی و رنگدانه است.

 این پروتئین در حلال های قطبی از جمله آب حل می شود، در محلول های اسیدی یا قلیایی هیدرولیز شده و در معرض پروتئازها تجزیه می شود.

با این وجود پپتیدهای هیدرولیز شده سریسینخواص مرطوب کنندگی فوق العاده ای دارند و پپتیدهای سیگ۔ اثر آن (کمتر از ۲۰ کیلو دالتون) در صنایع آرایشی از قبیلمحصولات مراقبت پوست و مو، صنایع بهداشتی و داروسازی به کار می روند، پپتیدهای سنگین تر (بیشتر از ۲۰ کیلو دالتون) به عنوان بیومتریال های تخریب پذیر، پلیمرهای و غشاهای زیستی ، هیدروژل ها کاربرد دارند.

فيبروتين، یک پروتئین رشته ای و نامحلول در آب است که به طور متوسط ۷۸ وزن پیله را بهخود اختصاص داده است.

امروزه مشخص شده است اجزاء تشکیل دهنده ساختار ابرمولکولی تارهای ابریشم ماکروفیبریل هایی هستند که عرضشان به ۱۰۵*۵٫۶ نانومتر می رساند و به نوبه خود از تاتو فیبرل های تاییدهای با قطر ۹۰  الى ۱۷۰ نانومتر تشکیل شده اند که نقش مهمی را در ایجاد استحکام ابریشم دارند.

اما از دیدگاه مولکولی و پروتئین فيرونين متشکل از دو رشته سنگین و سبک پروتئینی با تست های مساوی است.

رشته سنگین ۳۷۰ کیلو دالتون وزن دارد و عمدتا از ماکرومولکول های آبگریز بسیار منظم ساخته شده است که طول آن ۱۵۰ تانومتر است.

رشته سبکتر ۲۹ کیلو دالتون وزن دارد و تشکیل دهنده های اصلی آن آمینو اسیدهای قطبی هستند.

زنجیره کوچک، ۰/۴۵ نانومتر طول دارد. ۹۰ درصد پروتئین قبیروئین از توالی و تکرار سه اسید آمینه اصلی گلایسین (۴۳)، ألانين (۳۰) و سري” (۱۲) به وجود آمده است

ساختمان ثانویه قبیروئین از طریق برهمکنش های گوناگونی شکل می گیرد که مهم ترین آن ایجاد پیوندهای هیدروژنی بین گروههای عاملی زنجیرهای پپتیدی و زنجیره های جانبی اپرمولکول است.

وجود همین پیوندهای هیدروژنی دلیل اصلی استحکام کششی فوق العاده فیبروئین ابریشم است.

ترکیب بلوکهای آبگریز منظم با بلوک های نسپنا نامنظم آبدوست، سبب افزایش الاستیسیته و چقرمگی فیروئن میشود.

خواص مکانیکی ابریشم در مجموع با بهترین الیاف مصنوعی، از جمله کولار”، قابل رقابت است.

خواص مکانیکی الیاف ابریشم تلفیق بسیار مناسبی از سیکی و استحکام کششی زیاد است.

امروزه سه ساختار ثانویه اصلی برای فیبروئین مشخص شده است که در محل های بلورین به شکل پیچ آلفا و صفحات پتا است و به ترتیب به آنها ۱ Silk و Silk II می گویند در محل های آمورف این ساختار به صورت ترکیب نامنظمی از گلبول های تصادفی است( Silk III).

ساختار فیروئین تنیده شده به طور متوسط : صفحات بتا و ۵/۱۳ درصد از پیچ آلفا تشکیل شده  است

 ابریشم غیر بلورین، در تماس با متانول با کلرید پتاسیم تغییر شکل داده و به ساختاری با صفحات با تبدیل میشود

این رفتار امکان بازیابی ساختار غیر بلورین قبروتين محلول در آب را امکان پذیر می سازد.

فیبروئین ابریشم پس از بازیابی مجددا ساختار نامحلول در آب پیدا می کنند. دلیل این امر آن است که ساختارهای صفحه ای با نامتقارن بوده و در یک سمت شامل زنجیره های جانبی هیدروژن از گلایسین و در سوی دیگر با گروههای متیل آلانين احاطه شاد داند که در آب و سایر محیط های حاوی اسید با قلیای ضعیف حل تمی۔شوند.

این واقعیت آنجا اهمیت می یابد که سبب می شود اشكال متنوعی از ابریشم را تولید کرد.

توانایی فیبروئین ابریشم در خودآرایی و امکان فرآوری آن در اشکال گوناگونی مانند، داربست، ژل، فوم، فیلم، کپسول و غیره در نهایت سبب شده تا برای این ماده زیست سازگار کاربردهای فراوانی در زمینه های نوین پزشکی فرض شود.

شرح مسئله

تولید ابریشم از دیر باز یکی از صنایع بومی منطقه شمال کشورمان (ایران) بوده که نزدیک به ۱۰۰درصد تولید آن در صنعت نساجی بکار گرفته می شود.

کشف قابلیت های بی همتای ابریشم حضور این الیاف تاریخی را در عرصه های نوین علم و تکنولوژی بسیار پرنگ تر از گذشته کرده است.

وجود ویژگی های منحصر بفردی چون زیست سازگاری شکل پذیری، تخریب پذیری کنترل شده و استحکام مکانیکی بالا سبب تمایل به استفاده از این ماده در فن آوری های نوین از جمله زیست پزشکی شده است.

این پژوهش با هدف دست یابی به ماده اولیه قابل فرآوری از پروتئین ابریشم در زمینه های زیست پزشکی از جمله مهندسی بافت استخوان و پوست انجام شد.

الیاف صمغ زادیی شده ابریشم با رشته های فیبروئین با ساختار مستحکم صفحات پتا (Silk II) در آب نامحلول هستند.

بنابراین باید ساختار سوم و دوم آن به قرم پیچ آلفا (۱ silk) قابل حل در آب تبدیل شود تا امکان تهیه محلول و به تبع آن اشکال دیگر از جمله ژلها و اسفنج ها برای کاربردهای مهندسی بافت) از آن ممکن شود.

استفاده از محلول تمک های غلیظ برای بر هم زدن تعادل برهمکنش های میان زنجیره های پروتئین یکی از راههای باز کردن زنجیره ها و حل کردن آن است.

در این فرآیند از محلول لیتیم برماید با غلظت بالای پونها استفاده میشود تا ساختار قضایی فيروئین را بر هم بریزد.

استفاده از غشاء دياليز در نهایت این امکان را به دست می دهد که مولکول های درشت فیبروئین ابریشم از نمک غليظ جدا شده و خالص و قابل حل گردند. فیبروئین بدست آمده از این روش قابل شکل دادن به صورت های گونگون است.

اما برای بازیابی قابلیت های اصیل فیبروئین ساختار باید بار دیگر به شکل صفحات با تغییر کند تا خواص مطلوب حاصل شود نظم زنجیره های سبک و سنگین و حوزه های آبگریز و آبدوست این پروتئین در مجاورت متاثل بازیابی می شود.

مشخصه یابی فیزیکی و زیستی فیبروتینی که به این روش از پیله های کرم بومبیکس موری تولید داخل بدست آمده است موضوع پژوهش حاضر است.

جهت مشاهده تعداد آنتی اکسیدان های پیله کرم ابریشم و چگوگی تاثیر مثبت آن بر روی پوست مقاله زیر را مشاهده نمایید.

کاربرد پیله ابریشم برای پوست و زیبایی + اثبات علمی

داده ها و روش حل

مواد

برای صمغ زدایی و استحصال فیبروئین نمک های کربنات سادهم Na2CO3، پر میدليتيم LiBr با خلوص بالای ۹۹/۹ درصد از شرکت (Merck ألمان) تهیه شد.

تیوب دیالیز با قابلیت عبور وزن مولکولی KDa 12-14  از شرکت (Sigma ألمان) خریداری شد.

آپ دوبار تقطير فوق خالص با ضریب هدایت کمتر از ۰/۰۰۵ میکرون توسط دستگاه تهیه آب فوق خالص (UPW) ساخت شرکت ( Sartorius آلمان) تهیه شد.

پیله های کرم بومبیکس موری از طرف مرکز تحقیقات ابریشم ایران در قالب هدیه تحقیقاتی دریافت شد.

برای انجام آزمون های زیست سازگاری، سلول های استئوبلاست انسانی رده: G292 از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شد.

محیط کشت DMEM کم گلوکز آماده  پنسیلین استرپتومایسین، سرم جنین گاوی TrypsinEDTA FBS از شرکت (. gib – Co آمریکا) و محلول آماده MTT وDMSO از شرکت (Sigma آلمان) خریداری شدن

صمغ زدایی و استحصال فیبروئین ابریشم

پیله های کرم بومبیکس موری در روز پنجم برداشت و شفيردها داخل آن با بخار آب داغ کشته شدند.

به منظور صمغ زدایی الیاف ابریشم، سه عدد پیله کرم بومبیکس موری باز و محتوی آن را خارج شد. سپس پیله ها در ۷۵۰ میلی لیتر Na2CO3  مولار۰/۰۲  به مدت یک ساعت قرار داده شد.

الباف بدست آمده ۳ بار با یک لیتر آب دیونیزه سرد و گرم به خوبی آب کشی و به مدت یک شب در زیر هود خشک شد برای تهیه فیبروئین محلول در آب، الياف صمغ زدایی شده ابریشم به نسبت ۱۰ وزنی در محلول ۳/۹ مولار ليتيم برمایا به مدت ۲ ساعت در ۵۵ درجه سانتی گراد حل شد.

محلول غلیظ نمک و فیبروین به مدت ۳ ساعت در غشاء دیالیز با ضریب خروج ۱۲۰۰۰ دالتون در یک لیتر آب فوق خاص قرار داده شد.

آب ظرفی که کیسه دیالیز در آن قرار داشت ۹ بار به طور منظم تعویض شد. محلول باقی مانده در غشاء دپالیز به مدت ۱۲ ساعت در فریز دار پر خشک شد تا فیبروئین خالص قابل حل در آب بدست آید.

فیبروئین استحصال شده به این روش به صورت پودر سفید رنگ و قابل نگهداری در دمای محیط است. شكل ۲ مراحل تهبه فیبروئین را نشان می دهد.

برای بازیابی ساختار صفحات با فیبروئین باید به مدت حداقل ۳۰ دقیقه در مجاورت مثال ۹۹ درصد قرار گیرد.

مشخصه یابی فیزیکی و شیمیایی

به منظور تابید حضور پیوندهای آمینی ویژه پروتئین فیبروتین، آزمون طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز توسط دستگاه FTIR مدل ۵۵ EQUINOX در بازه ۵۰۰-۴۰۰cm طبق استاندارد ۰۷-ASTM E1252 انجام شد.

برای انجام این آزمون از پودر فیبروئین و پودر KBr فرص هایی تازگی تهیه شد و در دستگاه قرار گرفت.

برای بررسی میزان بلورینگی و مطالعه تغییرات قبل و بعد از تاثیر مثانول بر ساختار ثانویه مولکولی و بلورینگی فیبروئین، آزمایش پرایش پرتو ایکس توسط دستگاه XRD مدل D5000 SIMENS در بازه ۲ (۵-۷۰) درجه بر روی فیبروتين قبل و پس از بازیابی انجام شد.

تارهای ابریشم قبل و پس از صمغ زدایی توسط میکروسکپ الکترونی روبشی، دستگاه SEM مدل XLPhilips 30 / ESEM در وضعیت فیلد امیزن با مد الكترون ثانويه ( SE) مورد بررسی قرار گرفتند.

آزمون زیست سازگاری

برای انجام آزمون زیست سازگاری بر روی فیبروئین فیلم فیبروئینی بازیابی شده تهیه شد.

برای ایجاد یک لایه نازک فیبروتینی پر کف ظرف کشت ۱۰۰ میکرولیتر از محلول ۸ وزنی فیبروئین در داخل چاهک ظرف گشت پخش شد و به مدت یک شبانه روز زیر هود استیل خشک شد.

برای بازیابی ساختاری و نامحلول کردن آن در آب، لایه نازک فیبروتنی به مدت ۳۰ دقیقه در مجاورت منائل ۹۹ درصد قرار گرفت و سپس ۲ بار به طور کامل با PBS شستشو داده شد.

برای بدست آوردن تعداد سلول های مورد نیاز سلول های استئوبلاست انسانی رده Gi292 در محیط کشت DMEM کم گلوکز حاوی ۱۰ واحد در میلی لیتر پنیسیلین و ۱۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر استرپتومایسین، ۹٪ سرم جنین گاوی FBS در ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور مرطوب حاوی ۵ درصد co2 و ۹۵ دصد هوا ، تکثیر شد.

برای انجام آزمون ظرف کشت حاوی لایه های نازک با الكل ۷۰ درجه و تابش UV استریل شد. ۱۰۰۰۰۰ سلول استئوبلاستی در چاهک پوشش داده شده و به مقدار مساوی در چاهک کنترل ریخته شد.

تفسير و تحليل نتایج

به طور کلی چهار نوع مختلف از پیکهای ارتعاشی مربوط به گروههای آمیدی در پروتئین ها وجود دارد.

پروتشین ها پیکهای شاخصی را در فاصله – cm1930 تا – cm 950۰ برای آمیدا ( ۰=Cکششی)، در فاصله  cm1520 تا – cm 1540 برای آمید NH )II ثانویه، خمشی) و در فاصله – cm 1230 تا  cm 1270 برای آمید C– N , N – 1 ) III گروههای عاملی)در طبق IR خود نشان می دهند.

بررسی طبق IR پلی پپتیدها را در ساختارهای مختلف در باندهای آمیذ۱ ر ۲ نشان می دهد پیک پلی پپتیدها در فرم هلیکس برای باندهای آمید۱ را در  cm1655 ظاهر می شود. امید II نیز در فرم صفحات موازی در ۱۵۳۰ cm پیک نشان می دهد.

پیک \cm 1655 نیز برای آمید ۱در فرم پیچ های درهم پروتئین هایی که گروههای پپتیدی آنها با گروه های مجاور پیوند هیدروژنی برقرار کرده اند د پیاده میشود.

 شكل ٣ الف طيف FTIR بدست آمده از پژوهش حاضر است حضور بارز باندهای آمید ۱ در ۱۶۵۵ cm و أميدا ۲  در۱۵۳۰ cm  و تایید آن در cm699 و آميد III در cm 1239 وجود پروتئین را در ساختار مارپیچی و پیج های درهم کاملا تایید می کند.

با مقایسه این نمودار و طبق FTIR ابریشم پوبیکس موری بدست آمده توسط دیگر محققان این اطمینان حاصل می شود که پروتیئن حاضر فیبروئین است (شكل ۳ب)۔

آزمون پراش پرتو ایکس به منظور بررسی تغییر میزان بلورینگی قیبر وین استحصال شده در دو مرحله قبل و بعد از بازیابی توسط متانول انجام شد.

نتایج آزمون پراش پرتو ایکس در شكل ۴ آمده است.

نتیجه گیری

با توجه به کاربردهای نو ظهور پروتئین ابریشم در زمینه فناوری های نوین از جمله زیست پزشکی، استخراج فيروئين از پیله کرم بو میکس موزی به عنوان یک منبع اقتصادی و بومی ایرانی ابریشم مورد بررسی قرار گرفت.

فیبروئین ابریشم استحصال شده در این پژوهش دارای خلوص مورد نظر و خواص مطلوبی از جمله شکل پذیری و زیست سازگاری است.

عذم سمیت و رشد سلول های استوبالاست پر واری فیلم های تهیه شده از فیبروئین ابریشم بازیابی شاده نشان می دهد این ماده برای ساخت مواد مرتبط با سیستم های زنده قابلیت های بالقوه فراوانی دارد و می توان با استفاده از پیله ابریشم به عنوان یک کاندید مناسب در زمینه های مختلف زیست پزشکی از جمله ساخت غشاها داربست ها و لایه های نازک استفاده کرد

منبع:

استحصال و بررسی خواص فیبروئین ابریشم بومبیکس موری برای کاربرد های پزشکی

صهبا مبینی – مهران صولتی هشجین – حبیب اله پیروی – علی صمدی کوچکسرایی

دانشگاه صنعتی امیر کبیر